细胞培养过程中会遇到哪些问题?解决方案在这里


细胞培养实验中,经常会遇到很多问题,为解救细胞,就得对症下药才行。一般细胞出现问题的原因可以从5个方面来着手。只要抓住这5点,救细胞就是小case。



一、细胞自身问题

种子好不好很重要


如果你使用的细胞已经是很多代之后的了,培养的时候就会力不从心,可以重新复苏更原始的细胞进行培养。

如果你使用的是冻存的细胞,那就有可能在冻存时该细胞的增殖能力就很弱了,可以通过查看以往的操作记录来判断。


还有一点就是个体差异,可以在培养前通过已知的标准对样本进行筛选,从而减少个体差异带来的影响。


二、外源污染

如果相同来源的其它批次的细胞并没有出现问题,你就要思考一下你是不是“中奖了”。请及时对可疑细胞以及培养使用的试剂进行隔离。


细菌污染

细菌是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μm)计。


常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。


一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象;有时静置的培养液液体初看不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类;有的培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min,沉淀中加入无抗生素的培养液2ml,置于37℃培养,24h可得结果。


污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。


解决方案:

(1)丢弃所有已经污染的细胞和培养基

(2)培养环境用新洁尔灭擦拭且UV灭菌24小时;

(3)培养试剂中加入P/S双抗;

(4)尽可能使用一次性耗材及成品培养基;


真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。


污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。


霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。


真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。


解决方案:

(1)丢弃所有已经污染的细胞和培养基;

(2)培养环境用甲醛熏蒸;

(3)培养试剂中加入两性霉素B;

(4)尽可能保持细胞培养环境的干燥;

(5)注意戴帽子和口罩;

(6)尽可能使用一次性耗材及成品培养基;


支原体污染

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2μm并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。


支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构.其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似,但微绒毛电子密度比支原体小,且中央无颗粒群或中央束。


支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、氧气、葡萄糖,每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6~8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。


支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。


解决方案:

(1)丢弃所有已经污染的细胞和培养基;

(2)使用支原体清除试剂擦拭培养箱及超净工作台;

(3)培养试剂中加入支原体清除试剂;

(4)注意戴帽子和口罩;

(5)尽可能使用一次性耗材及成品培养基;


黑胶虫污染

黑胶虫可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液不浑浊,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。数量不多的时候对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。


原虫污染

培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,最终形成恶性循环。


病毒污染

组织细胞培养过程中,如果没有除去潜在的病毒,就会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。


交叉污染

共用试剂、耗材,同时操作不同的样本,都极易造成交叉污染。交叉污染之王应该属于HeLa细胞了,世界上已有很多细胞都受其污染,致使许多实验宣告无效。


三、实验设备

细胞培养用的超净台、细胞培养箱,最好买比较好的品牌。但是别以为买了大公司的仪器就可以高枕无忧,设备最好要定期检修的,比如超净台的过滤膜要定期更换,有时培养箱上的显示器明明显示二氧化碳浓度为5%,其实际情况却可能已经<5%了。

仔细观察细胞培养液的颜色,如果培养液偏紫红,那可能是培养箱中二氧化碳浓度不达标导致PH值偏碱,最好及时更换培养环境,重新调试培养箱。


四、试剂

在细胞培养实验中,如果出现使用同批次试剂培养的细胞大部分都出现问题情况,就需要锁定是否是试剂的问题导致的。


首先我们应该先要检查试剂的规格、效价是否与之前一致,如果有改变则需根据情况修改加入的量;


然后我们要检查试剂的品牌是否与之前一致,如果有更换应验证该品牌是否能适用于这类细胞。


最后我们要检查试剂的有效期是否过期、存放位置是否有问题、是否反复冻融等,以免试剂已因此而失效。


总的来说,就是要选对试剂、买真试剂、验证好试剂、保存好试剂、正确使用试剂。要购买正品的试剂,可以选择广州安邦生物科技有限公司噢!



五、操作问题

对于操作问题我们不应回避,其实很多实验出问题都是操作不当导致的。对于严谨的实验来说,真是细节决定成败。



细胞培养是一个不断进步的过程,要想成为达人,看几篇文章哪够?在平时做好积累,量变才会有质变。


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