细胞凋亡 WB 没成功,你是不是用了 RIPA?

      细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程,通常表现为核浓缩,起皱,膜发泡以及 DNA pian段化。WB 是研究细胞凋亡机理的基本方法之一,但是 WB 也不是谁都能做成功的,因为有可能你的步就做错了!用 WB 做细胞凋亡研究样品制备是步,样品制备方法至关重要否则会得到错误的结果和结论。

样品制备,看你是不是这样做的:

自配裂解液或者购买 RIPA,加上样品研磨啊研磨,孵育啊孵育,然后离心扔掉沉淀(RIPA 不可溶组分),取上清(RIPA 可溶组分)进行下游实验。

对对对!都是这么做啊,扔了取上清!

且慢,我们扔掉了,扔掉了,扔掉了一些啥?要不要紧,影响细胞凋亡的实验结果不?

例一. Zapata et al., (1998). Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.

 

Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中 caspase-3 为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的 Caspase-3 由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase 的活性明显下降。

➤ 研究方法

1. 分别使用 RIPA 和 2%SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞(Lanes 1 和 5)和激活的 T 淋巴细胞(Lanes 2-4 和 6-8)裂解细胞提取总蛋白

2. WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 检测

➤ 主要发现

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中,但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 缓冲液加超声处理可进一步从 RIPA 不可溶性组分中提取出蛋白。

例二.Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.

 

➤ 研究方法

1. MCF10A-5E 人ru腺上皮细胞激活 Fas 死亡受体,无激活组为对照

2. 分别用 NP-40(不含 SDS 和脱氧胆酸盐),RIPA buffer, Laemmil(SB)样品缓冲液提取蛋白

3. WB 进行 Clv-caspase-8 检测, Hsp90,Tubulin,P38 作为对照

➤ 主要发现

结果显示,仅在 Laemmil 缓冲液提取的样品中检测到激活形式的 Caspase-8,而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白样品中均未检测到。证明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱,某些特定蛋白会因刺激方式在可溶性和不可溶性组分之间移动。

例三.CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010

 

➤ 研究方法

1. MDA-MB231 细胞,分别用 shCon,shSnail 质粒转染,分别培养于普通培养基及 GD 培养基 12 小时

2. 使用 RIPA 提取蛋白,分别将 RIPA 可溶性组分和 RIPA 不可溶性组分进行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1,WB 检测。

➤ 主要发现

某些特定刺激诱导凋亡后,P53,caspase3,caspase9 等会聚集在 RIPA 不可溶组分中,不可溶性组分中 P53 和 caspase 9 信号甚至比可溶性组分中更强,表明目标蛋白在 RIPA 不可溶组分中显著丢失。证明 RIPA 并不能提取到真正意义上的总蛋白,丢掉的不可溶组分中还有很多蛋白,甚至是目标蛋白。

例四 .SU YEON LEE,et al(2010).Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010

 

➤ 研究方法

1. MCF-7 细胞培养 4-9 天后,用 RIPA 分别进行蛋白提取,分为 RIPA 可溶性组分和不可溶性组分两组

2. SDS-PAGE 后,立春红染色(图 A),用 WB 分别检测 p53,CuZnSOD,MnSOD,Tubulin(图 B)

➤ 主要发现

MTS 培养过程中,RIPA 不可溶性组分中蛋白增加,可溶性组分和不可溶性组分蛋白图谱有很大差异,胞浆中的 CuZnSOD 和线粒体中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性组分中,而 p53 和 tubulin 则在 RIPA 可溶性和不可溶性组分中都存在。这表明,如果仅使用可溶性组分研究目标蛋白的定量,则结论可能是不准确或出现偏颇。

看了一圈下来,细胞凋亡 WB 没成功的原因,很可能就是因为你用了 RIPA!

RIPA 不适合做细胞凋亡 WB 检测的原因

1. RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。

2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱,目标蛋白及内参蛋白常常会丢失在被丢弃的不可溶组分中,仅使用可溶性组分研究不严谨。

3. RIPA buffer 提取的蛋白图谱偏差会得出错误或偏差结论,特别是涉及目标蛋白的定量问题时。

 

 

网友回帖

0条回帖